Πρωτεΐνες με επίδραση στην σύναψη των χρωμοσωμάτων

Γονίδια και άλλων τύπων έχουν συμπεριληφθεί στην διαδικασία που είναι απαραίτητη για την σπερματογένεση στα ποντίκια. Πρόκληση εσκεμμένης βλάβης στην πρωτεΐνη θερμικού σοκ Hsp70-2 η οποία εκφράζεται ειδικά σε μειωτικά σπερματοκύτταρα , οδηγεί σε αποτυχία της μείωσης και ανδρική υπογονιμότητα, πιθανότατα επιδρώντας στο σχηματισμό του συμπλέγματος των χρωμοσωμάτων κατά την διάρκεια της σύναψης. Μία δεύτερη  πρωτεΐνη θερμικού σοκ η Hsc70tp εκφράζεται ειδικά στις στρογγυλές σπερματίδες.

Δύο από τα ποιο σημαντικά γονίδια που συμμετέχουν στην διαδικασία της μείωσης είναι τα γονίδια επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων  Pms2 και Mlh1. Αυτά τα γονίδια διερευνώνται εντόνως εξαιτίας της σχέσης τους με την εμφάνιση ορισμένων μορφών κακοήθειας. Αλλά όταν τα Pms2 και Mlh1 λείπουν ομόζυγα τότε επιδρούν στο ζευγάρωμα κατά την διάρκεια της μείωσης. Στην περίπτωση έλλειψης  του  Mlh1 έχουμε την εμφάνιση ανδρικής και γυναικείας υπογονιμότητας με τα αρσενικά να μην παράγουν σπερματίδες και τα θηλυκά  να παράγουν μειωμένο αριθμό ωοκυττάρων . Ομοζυγώτες στην έλλειψη  Pms2 είναι γόνιμοι ως θηλυκά και στείροι ως αρσενικά.

Άλλες πρωτεΐνες με λειτουργίες στη μείωση είναι οι ATM , ATR. Το γονίδιο της ATM αρχικά απομονώθηκε ως το γονίδιο που μεταλλάσσεται στη ataxia-telangiectasia. Συμμετέχει στον μεταβολισμό του   DNA. Είναι πολύ στενά συνδεδεμένο με το γονίδιο ATR το οποίο είναι το αντίστοιχο γονίδιο για το RAD3 που εντοπίζεται στην μαγιά . Αυτό το γονίδιο είναι απαραίτητο για την διεκπεραίωση λειτουργιών που πυροδοτούνται σε βλάβες του DNA. Έλλειψη του ATM στα ποντίκια οδηγεί σε υπογονιμότητα και θραυσματοποίηση χρωμοσωμάτων κατά την διάρκεια της μείωσης καθώς και στην εμφάνιση άλλων χαρακτηριστικών που σχετίζονται με την παθολογία της  ataxia-telangiectasia.

ΕΡΕΥΝΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΞΕΤΑΣΗ  ΜΙΚΡΟΕΛΛΕΙΨΕΩΝ ΣΤΟΝ ΑΖΩΟΣΠΕΡΜΙΚΟ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ

Σκοπός :  Ο σκοπός της έρευνας είναι η εξέταση των προτύπων των μικροελλείψεων του DNA που εντοπίζονται στην περιοχή του αζωοσπερμικού παράγοντα του Υ χρωμοσώματος σε ασθενείς με ιδιοπαθή αζωοσπερμία.

Υλικά και μέθοδοι

Μη γόνιμοι άνδρες συγκεντρώθηκαν από την κλινική υπογονημότητας του Εθνικού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου της Σεούλ. Όλοι οι ασθενείς υπεβλήθησαν σε αναλύσεις σπέρματος. Επιπρόσθετα αποκτήθηκε το πλήρες ιστορικό του κάθε ασθενούς και πραγματοποιήθηκαν ιατρικές εξετάσεις. Η αζωοσπερμία πιστοποιήθηκε με δύο διαφορετικές αναλύσεις , κάθε μία πραγματοποιήθηκε μετά από τριήμερη περίοδο σεξουαλικής αποχής που χωρίζονταν από ένα διάστημα 3εβδομάδων, σύμφωνα με τις οδηγίες της παγκόσμιας οργάνωσης υγείας.

Χρωμοσωμικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε καλλιέργειες λεμφοκυττάρων με την τεχνική GTG. Επίσης μετρήθηκαν τα επίπεδα  τεστοστερόνης , FSH, και LH .Ακόμη διεξήχθησαν βιοψίες όρχεων με την συγκατάθεση των ασθενών.

Σύνδρομο μόνο κυττάρων Sertoli (SCOS) διαγιγνώσκεται μόνο όταν όλο το υλικό που αποκτήθηκε και από τους δύο όρχεις περιέχει μόνο κύτταρα Sertoli. Σπερματογονική διακοπή διαγιγνώσκεται  όταν τα σωληνοειδή  δεν περιέχουν  σπερματοζωάρια αλλά μόνο αναπτυσσόμενα σπερματοκύτταρα και σπερματίδες. Χρησιμοποιώντας αυτά τα κριτήρια επιλέξαμε τους ασθενείς που έπασχαν από ιδιοπαθή αζωοσπερμία και είχαν αμφίπλευρο SCOS και σπερματογονική διακοπή και των οποίων οι καρυότυποι ήταν φυσιολογικοί.

Αλληλουχία περιοχων προσκόλλησης

(Sequence-Tagged –Sites STS)

Ανάλυση ελλείψεων μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Γενωμικό  DNA  αποκτήθηκε από περιφερικά κύτταρα του αίματος και 9 δοκιμασίες PCR  ενισχύθηκαν κάθε μία περιέχοντας 3-5 ζεύγη εκκινητών . PCR ανάλυση πραγματοποιήθηκε με 100 ng           γενωμικού DNA σε τελικό όγκο 25μl συμπεριλαμβάνοντας και ρυθμιστικό διάλυμα.Τα προϊόντα της PCR  χωρίστηκαν σε διάλυμα 2% αγαρόζης με  ηλεκτροφόρηση. Απάλειψη ενός συγκεκριμένου γενετικού τόπου στο Υq11 προκύπτει από την αδυναμία ενίσχυσης από δύο ανεξάρτητες  PCR .

Αποτελέσματα

Η ιστολογική ανάλυση των όρχεων έδειξε ότι 36 άτομα έπασχαν από το σύνδρομο Sertoli ενώ 4 εμφάνιζαν διακοπή της σπερματογένεσης . Μικροελλείψεις του Υ χρωμοσώματος βρέθηκαν σε 8(20%) από τους ασθενείς με αζωοσπερμία . Και οι 8 ασθενείς είχαν μικροελλείψεις  στην υποπεριοχή AZFc  . Ασθενείς με το σύνδρομο Sertoli εμφάνισαν μικροελλείψεις σε περιοχές του γονιδίου DAZ (7στους 8).  Σε 5 ασθενείς εμφανίστηκαν μικροελλείψεις στην περιοχή AZFb όπου βρίσκεται το γονίδιο RBM .

7στις 8 μικροελλείψεις εντοπίζονται στην περιοχή του γονιδίου DAZ ()

Σε τρεις περιπτώσεις (ασθενείς 2,3,4) οι μικροελλείψεις εντοπίζονται στην υποπεριοχή  AZFb. ().

Σε επτά ασθενείς μικρές ελλείψεις βρίσκονται διάσπαρτες από περιοχές που αντιστοιχούν στο μέχρι το στην υποπεριοχή AZFc  .

Σε τέσσερις ασθενείς(2,6,7,8)εντοπίστηκε μία μεγάλη έλλειψη στην περιοχή του γονιδίου DAZ στο σημείο

Σε ασθενείς με σύνδρομο Sertoli  (1-6) οι  μικροελλείψεις ήταν παρούσες στις υποπεριοχές AZFc AZFb.Στους ασθενείς με διακοπή σπερματογένεσης οι μικροελλείψεις περιορίστηκαν  μόνο στην περιοχή AZFc.Δεν εμφανίστηκαν ελλείψεις στην υποπεριοχή AZFa.